產品介紹
Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8試劑盒，是MTT，XTT等的替代方法，一種基于WST-8（水溶性四唑鹽，化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。CCK-8溶液可以直接加入到細胞樣品中，不需要預配各種成分。WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的Formazan。對于同樣的細胞，顏色的深淺(生成的Formazan量)和細胞數目呈線性關系?？捎糜谒幬锖Y選、細胞增殖和毒性測定、腫瘤藥敏等試驗。
操作步驟
一. 制作標準曲線（測定細胞具體數量）
1.先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞；
2.按比例依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做4-7個細胞濃度梯度，每組3-6個復孔；
3.接種后培養2-4小時使細胞貼壁，然后加入CCK-8試劑（按每100 μL培養基加10μL CCK-8）培養一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數量為橫坐標，OD值為縱坐標的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量。（使用此標準曲線的前提條件是試驗條件完全一致）
二. 細胞活性檢測
1.在96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔)，將培養板放在培養箱中預培養一段時間；
2.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要產生氣泡，它們會影響OD值的讀數)；
3.將培養板置于培養箱內孵育1-4小時；
4.用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。
三.細胞增殖-毒性檢測
1.在96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔)，將培養板放在培養箱中預培養24小時；
2.向培養板加入不同濃度的待測藥物；
3.將培養板在培養箱孵育一段適當的時間；
4.向每孔加入10μL的CCK-8溶液(注意不要產生氣泡)；
5.將培養板置于培養箱內孵育1-4小時；
6.用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。
注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8 之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次， 然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。
四.活力計算
細胞存活率*（%）=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
抑制率*（%）=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As:實驗孔吸光度(含細胞、培養基、CCK-8 溶液和藥物溶液)；
Ac: 對照孔吸光度 (含細胞、培養基、CCK-8 溶液，不含藥物) ；
Ab: 空白孔吸光度 (含培養基、CCK-8 溶液，不含細胞、藥物) 。
保存條件
4℃避光保存，有效期12個月；-20℃避光保存，有效期24個月
實驗應用
1. 細胞增殖測定：CCK-8是水溶性的，在培養基中穩定且無毒。
2. 細胞活性分析，包括細胞毒性：代謝活性以及染料的形成與細胞的活性和損傷成比例。
3. 細胞因子分析：測定細胞因子誘導的增殖，必要時，可在試驗結束時回收和擴增細胞
注意事項
1.CCK-8的培養時間一般為1-4小時，但在培養30分鐘左右即可取出肉眼觀察顯色程度，根據細胞種類而定，需要摸索條件，CCK-8的最佳反應時間以具體顯色的最佳時間為準。
2.使用96孔板進行檢測時，如果細胞培養時間較長，一定要注意蒸發問 題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS,水或培養液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養箱內水源的地方，以緩解蒸發。
3.本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應，所以還原劑 (例如一些抗氧化劑)會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定。
4.加入藥物中如含有金屬，對 CCK-8 顯色有影響。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%,15%,90% 的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話，將會100% 抑制。
5.培養基中的酚紅不會影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
6.本產品可以檢測革蘭氏陰性細菌，但不能檢測革蘭氏陽性細菌和酵母細胞。向100μL培養液中加入10μL CCK-8溶液，并培養1-4小時或過夜。
7.CCK-8試劑對細胞的毒性非常低。它和活細胞內的脫氫酶持續反應使溶液顏色不斷加深，OD值不斷增加(注: 活細胞內的脫氫酶是持續產生的)。
8.要測定細胞的具體數量，建議同時做標準曲線。
9.建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。
10.以下方法可以終止CCK-8反應(96 孔板)：(a).在顯色反應后，將培養板放置4°C冰箱內。(b).每孔加10μL 0.1M HCl溶液。(c).每孔加10μL 1% (w/v) 的SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液。注意：反應停止后，應在24小時內測定。
11. 本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。
12. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
【1】Tian Y, Li Y, Liu J, et al. Photothermal therapy with regulated Nrf2/NF-κB signaling pathway for treating bacteria-induced periodontitis[J]. Bioactive materials, 2022, 9: 428-445. （IF=14.593）
【2】Zhang H, Zhang S, Duan Z, et al. Pulmonary toxicology assessment of polyethylene terephthalate nanoplastic particles in vitro[J]. Environment International, 2022, 162: 107177. （IF=9.621）
【3】Li M, Jin S, Zhang Z, et al. Interleukin-6 facilitates tumor progression by inducing ferroptosis resistance in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Cancer letters, 2022, 527: 28-40. （IF=8.679）
【4】Mo L, Liang D, He W, et al. Ratiometric and amplified fluorescence nanosensor based on a DNA tetrahedron for miRNA imaging in living cells[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2021, 9(39): 8341-8347. （IF=6.331）
【5】Zhang J, Qiu T, Jiang L, et al. NLRP3 inflammasome blocked the glycolytic pathway via targeting to PKLR in arsenic-induced hepatic insulin resistance[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2021, 223: 112590.（IF=6.291）
【6】Zhu Y, Zhang J, Yao X, et al. Ubiquitinated gasdermin D mediates arsenic-induced pyroptosis and hepatic insulin resistance in rat liver[J]. Food and Chemical Toxicology, 2022, 160: 112771. （IF=6.023）
【7】Yang Y, Zeng Q S, Zou M, et al. Targeting Gremlin 1 prevents Intestinal Fibrosis Progression by inhibiting the fatty acid oxidation of fibroblast cells[J]. Frontiers in pharmacology, 2021, 12.（IF=5.810）
【8】Pan X, Guo J, Liu C, et al. LncRNA HCG18 promotes osteosarcoma growth by enhanced aerobic glycolysis via the miR-365a-3p/PGK1 axis[J]. Cellular & Molecular Biology Letters, 2022, 27(1): 1-16. （IF=5.787）
